Mendeley 라이브러리의 참조를 기반으로 ACS에서 기사 권장 사항을 가져옵니다. 14C-락테이트 자가방사선은 R3230Ac 종양의 저산소(피모니다졸 염색에 의해 표시) v. 관류(Hoechst 염색으로 표시) 부위에서 비교되었다. 우리는 표지된 젖산이 저산소증이 결석한 잘 관류된 종양 지구에서 주로 채택되었다는 것을 것을을 발견했습니다 (그림 3C&D). 상당한 저산소증을 나타내지 않은 하나의 작은 종양에서, 14C-젖산염은 전체 섹션전체에 고르게 분포되었다(도 3E&F). 이 데이터는 제안된 대사 공생 모델 [17]과 일치하며, 유산균은 더 나은 산소화 종양 영역에 의해 우선적으로 취해진다. 조직 배양 접시(직경 15cm)를 2 및 3×106 세포 사이의 세포 밀도에서 도금하였다. 세포가 부착되도록 24시간 허용한 후, 또는 80% 응력을 달성한 후, 세포는 1x DPBS로 2회 세척한 후, 고포도당 DMEM(치료되지 않은 대조군), 포도당 없음(및 피루베이트 없음) DMEM + 12C (라벨이 없는) 젖산(라벨이 없는 제어) 또는 3-13C-젖산(Isotec, Sigme)으로 처리하였다. 세포는 4, 12 또는 24 시간 동안 노르목성 또는 저산소 조건에서 10-40 mM 3-13C 락테이트에 노출되었다. 잠복기가 끝날 때, 1 mL의 매체를 수집하고 즉시 -80°C에서 동결하였다. 이들 매체 샘플은 수출대사산물의 1H, 13C 및 HMQC 스펙트럼을 획득하는데 사용되었다. 세포를 DPBS로 2회 세척하였다. 대사산물 추출을 위해, 0.9 M 의 과염소산 1 mL, diH2O에서 10을 희석하고, 각 접시에 첨가하고, 세포를 긁어내었다.
샘플을 12,000 RPM에서 10분 동안 원심분리하여 펠릿 세포 파편 및 침전물. 상급제는 신선한 튜브로 옮겨졌고, 이것은 세포 용해물에서 NMR에 사용되었다. PFL의 X선 구조는 기질 피루브의 유사체인 옥사메이트(104) 및 피루브및 CoA(105)를 가진 복합체로서 해결되었다. PFL의 전체 구조는 클래스 I RNR의 것과 유사하며, 활성 부위는 비극성(β/α)10 배럴(135)에 위치한다(도 5C). 3개의 아미노산 잔기는 촉매 트라이아드를 형성하고, Gly734와 S의 Cys419의 Cα 사이의 거리는 3.7 Å이며, 기판 아날로그 옥사메이트의 C2와 Cys418 및 S의 Cys419 사이의 거리는 각각 3.3 및 3.7 Å이다. 따라서 글리실 라디칼(Gly734)이 Cys419로부터 수소 원자를 직접 추상화하여 티일 라디칼을 형성할 가능성이 높습니다. 도 5D에 도시된 메커니즘은 PFL에 대해 제안되었다. 기질 결합 형태에서, CoA의 글리코시딕 링키지는 `syn` 형태(105)에 있고, 그 SH그룹은 기판으로부터 멀리 떨어진다. CoA 글리코시딕 링키지가 기질없는 형태로 `안티` 형태인 경우, CoA의 SH 그룹은 활성 부위의 기판에 근접할 수 있다. 이들 효소의 글리실 라디칼은 동일한 오페론에서 효소 유전자에 인접한 유전자에 의해 인코딩되는 코그네이트 활성화 효소(activases)에 의해 생성된다(도 7B(a)(b)참조). 14C-젖산 자가 방사선 촬영은 젖산 섭취의 공간 분포를 연구하는 데 사용되었다.
R3230Ac 종양으로 이식된 심혈 누드 마우스를 14C-락테이트의 2μCi로 주입하였다. 저산소증 마커 약물인 피모니다졸(60 mg/kg i.p.)을 주입하였다. 30분 후, Hoechst-33342는 관류 마커 염료(10 mg/ml, 0.05 ml)로서 정맥내 투여되었다. 2분 후, 조직을 수확하고 스냅 냉동시켰다. 동결된 종양의 일부를 자가사염색, 회초염색 및 피모니다졸 염색을 위해 14 μm 두께로 저온절제하였다. 우리는 기계적 변화를 질적으로 비교하기 위해 P. aeruginosa PA14 라이브러리의 모든 돌연변이체에 대한 GRABS 점수를 결정하고 점수의 분포를 대략 정상으로 발견했습니다 (도 3A). 우리는 결과를 확인하기 위해 GRABS 점수가 -10 미만인 전체 게놈 화면에서 178개의 돌연변이를 다시 선별했습니다.
재스크리닝된 돌연변이체는 주로 부정적 GRABS 점수를 가졌고, 값의 분포는 전체 돌연변이 수집을 스크리닝하여 결정된 것보다 낮은 평균 GRABS 값(−17.5)으로 이동하였다(그림).
